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    技術支持

    蛋白質組學實用分析技術一覽

    發布時間:2022-05-07   點擊次數:246次

    分析其實也屬于技術的一部分,且在蛋白質組學研究中顯得尤為重要,因為蛋白質組學研究提供的數據是生物學上最龐大的,而且蛋白質組比基因組具有更大的復雜性,因此蛋白質組信息學更有挑戰性。今天小編先拋磚引玉地介紹幾個常用的分析方法和軟件。

    蛋白質定性分析

    蛋白質定性分析通常是指利用質譜法進行蛋白質鑒定和序列分析。蛋白質定性分析分為top-down分析和bottom-up分析兩種策略。目前,bottom-up分析策略被更廣泛的應用于蛋白質定性分析工作。

    根據使用儀器可分為:MALDI-TOF/TOF、LC-ESI-MS/MS

    根據樣本類型可分為:蛋白質全譜分析(即shotgun分析) 、蛋白質膠條/混合液分析、蛋白質膠點分析

    蛋白質全譜分析

    定義:蛋白質全譜分析也可稱為質譜shotgun分析,是指組分分析,能夠鑒定出盡可能多的肽和蛋白質分子。

    原理:將溶液內蛋白質分子或SDS-PAGE條帶的復雜混合物酶解成肽段混合物,通過液相色譜分離。串聯質譜測試,最后用相應的數據庫進行檢索匹配,可同時鑒定成百上千種蛋白質。主要應用于某一生理狀態下組織、細胞或者細胞器中所有表達蛋白質的鑒定。

    蛋白質膠條/混合液鑒定

    定義:利用LC-ESI-MS/MS蛋白鑒定技術對膠條樣本(即SDS-PAGE樣本)、IP、Co-IP、Pull-down等純化溶液等中等復雜樣本進行蛋白鑒定。

    原理:利用電噴霧(ESI)技術將樣品以離子化的方式從液滴表面蒸發,進入質量分析器。主要應用于蛋白質或多肽鑒定。

    蛋白質膠點鑒定

    定義:利用MALDI-TOF/TOF蛋白鑒定技術對考/銀染的2D或DIGE膠點樣本或者較純的蛋白樣本進行蛋白鑒定。

    原理: MALDI-TOF/TOF(Matrix – Assisted Laser Desorptiob/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,基質輔助激光解析電離飛行時間質譜)MALDI的原理是將樣品均勻包埋在基質中,基質吸收激光提供的能量而蒸發,攜帶部分樣品分子進入氣相,并將一部分能量傳遞給樣品分子使其離子化。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道,根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測,即測定離子的質荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比,從而檢測離子。 也主要應用于蛋白質或多肽鑒定。

    蛋白質相對定量分析

    相對定量的目的是測定目的蛋白在兩個或多個樣本中的表達量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的表達量。例如,如果研究項目中包括處理過的和未經處理的對照樣本,通??梢詫⑽唇浱幚淼臉颖局?定為基準,規定其目的蛋白濃度為100%,經處理的樣本的定量結果除以對照樣品的定量結果,就可以計算各個處理樣本的蛋白含量相對于未處理樣品的百分比。

    蛋白質絕對定量分析

    目前基于質譜的絕對定量蛋白質組學研究主要是指靶向蛋白質組學。靶向蛋白質組學分析,是指對目標蛋白質(或修飾肽段)進行定性和/或定量分析,或者用于驗證大規模蛋白質組學的結果?;谫|譜的靶向蛋白質組學分析方法,由于沒有物種限制并具備多目標同時分析能力等優勢,在相關研究領域已逐漸受到越來越多的關注和應用。其技術方法經歷了從傳統的SRM/MRM(選擇性/多反應監視,selected / multiple reaction monitoring)到PRM(平行反應監視,parallel reaction monitoring)的發展歷程。

    絕對定量蛋白質組學應用方向: 驗證定量蛋白質組學結果、驗證翻譯后修飾蛋白質組學結果、 目標蛋白質絕對/相對定量分析、診斷標志物靶向篩選、診斷標志物驗證與絕對定量、驗證基因表達產物。

    PRM

    定義:PRM是一種基于高分辨、高精度質譜的離子監視技術,能夠對目標蛋白質、目標肽段(如發生翻譯后修飾的肽段)進行選擇性檢測,從而實現對目標蛋白質/肽段進行絕對定量。

    原理:首先利用四級桿質量分析器的選擇檢測能力,在一級質譜中(Q1)選擇性地檢測目標肽段的母離子信息;隨后在collision cell中對母離子進行碎裂;最后利用高分辨、高質量精度分析器在二級質譜中檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片的信息。這樣即可對復雜樣本中的目標蛋白質/肽段進行準確地特異性分析。

    蛋白質翻譯后修飾分析

    翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM)是指對翻譯后的蛋白質進行共價加工的過程,通過在一個或多個氨基酸殘基加上修飾基團,可以改變蛋白質的理化性質,進而影響蛋白質的空間構象和活性狀態、亞細胞定位、折疊及其穩定性以及蛋白質-蛋白質相互作用。許多至關重要的生命進程不僅由蛋白質的相對豐度控制,更重要的是受到時空特異性和翻譯后修飾的調控,揭示翻譯后修飾的發生規律是解析蛋白質復雜多樣的生物功能的一個重要前提。常見的翻譯后修飾包括磷酸化、糖基化、乙?;?、泛素化等等。

    修飾蛋白質組學:質譜是鑒定蛋白質翻譯后修飾的重要方法,其原理是利用蛋白質發生修飾后的質量偏移來實現翻譯后修飾位點的鑒定;同時,由于翻譯后修飾的蛋白質在樣本中含量低且動態范圍廣,檢測前需要對發生修飾的蛋白質或肽段進行富集,然后再進行質譜鑒定。

    蛋白質組學生物信息學主要內容:

    蛋白功能注釋:亞細胞結構定位、GO分類、KEGG通路途徑、蛋白結構域、KOG/COG分類、FunCate2分類。

    功能富集分析:使用費歇爾確切檢驗方法,描述特定屬性蛋白群體(差異表達的蛋白、發生修飾的蛋白等)潛在調控的生理過程。分析包含:GO分類富集、KEGG通路富集、蛋白結構域富集、蛋白復合物富集。

    功能富集聚類分析:使用分層聚類的方法,研究不同實驗處理條件下對特定屬性全蛋白群體調控生理過程的影響。

    表達模式聚類分析:使用Mfuzz聚類方法對蛋白在不同處理條件(不同處理時間或藥物濃度)下表達譜的聚類分析。直觀的反應出處理時間或藥物濃度與蛋白表 達水平的關系。對得到的不同表達模式分類可以做進一步的功能富集聚類分析,揭示藥物潛在作用的蛋白與生理功能。

    修飾位點motif分析:分析翻譯后修飾位點附近氨基酸分布情況,預測潛在與該種修飾類型相關的保守序列區間。通過與蛋白結構域的聯系,為研究該種修飾類型作用和調控機制研究提供參考依據。

     

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