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    技術支持

    抗體純化:deaesephadexa50柱層析法

    發布時間:2022-06-14   點擊次數:71次

     一、原理
    deae-sephadex a-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠a-50)為弱堿性陽離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉變為OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點為pH6.85~7.5),其余均屬酸性蛋白。pH7.2~7.4的環境中,酸性蛋白均被deae- sephadex a-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通過柱層析,γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。

    1、試劑
    (1)鹽析提取的人γ球蛋白
    (2)0.5N NaOH,0.5N HCl 2M NaCl,10%NaN3
    (3)DEAE-Sephadex A-50,聚乙二醇(PEG)
    (4)0.1M,PH7.4 PB(配制見鹽析部分)

    2、器材
    (1)層析玻璃柱(1.3×40cm),滴定鐵架,自由夾,螺旋夾,尼龍紗(200目)
    (2)普通冰箱,751桮型紫外分光光度計,電導儀、抽濾裝置(包括抽氣機、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶),PH計
    (3)透析袋、座標紙、濾紙、PH精密試紙
    (4)量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等

    3、操作步驟
    (1)deae-sephadex a-50預處理
    稱deae-sephadex a-50(下稱a-50)5g,懸于500ml蒸餾水內,1h后傾去上層細粒。按每克a-50加0.5mol/l naoh 15ml的比例,將a-50浸泡于0.5mol/lNaOH液中,攪勻,靜置30min,裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾,并反復用蒸餾水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/l HCl同上操作過程處理,最后以0.5mol/l NaOH 再處理一次。處理完后,將a-50浸泡于0.1mol/l pH7.4PB中過夜。

    (2)裝柱
    ①將層析柱垂直固定于滴定架上,柱底墊一圓形尼龍紗,出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。
    ②將0.1mol/l ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的a-50。等a-50。等a-50凝膠沉降2~3cm高時,開啟出水口螺旋夾,控制流速1ml/min,同時連續倒入糊狀a-50凝膠至所需高度。
    ③關閉出水口,待a-50凝膠完全沉降后,柱面放一圓形濾紙片,以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

    (3)平衡
    啟開出水口螺旋夾,控制流速12~14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之pH值與離子強度,兩者達到一致時關閉出水口,停止平衡。

    (4)加樣及洗脫
    啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾,使柱中液體緩慢滴出,當柱面液體與柱面相切時,立即關閉出水口,以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應<床體積2%,蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進入柱內, 至與柱面相切時,立即關閉下口,以少量洗脫液洗柱壁2~3次;再放開出水口,使洗液進入床柱,隨后立即于柱面上加入數毫升洗脫液,緊塞柱上口,使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12~14滴/min。

    (5)收集
    開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。

    (6)測蛋白
    以751型紫外分光光度計分別測定每管OD 280nm, 與OD 260nm,按公式計算各管蛋白含量。并以OD 280nm為縱座標,以試管編號為橫座標,繪制洗脫曲線。

    (7)合并、濃縮
    將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并,以peg(mw6000)濃縮至所需體積,加入0.02% NaN3防腐,于4℃保存備用。長期保存時應貯于-40℃冰箱。

    (8)a-50凝膠的再生
    在柱上先以2mol/l NaCl洗脫蛋白至流出液的OD 280nm<0.02,再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將a-50再處理一遍即達到再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4℃保存;近期不用時,以無水酒精洗2次, 再置50℃溫箱烘干,裝瓶內保存。

    二、注意事項
    1、柱的選擇:從理論上說,只要柱足夠長,就能獲得理想的分辨率,但由于層析柱流速同壓力梯度有關,柱長增加使流速減慢,峰變寬,分辨率降低。柱的直徑增加,使流體流動的不均勻性增加,分辨率明顯下降。
    2、純化過程必須嚴格控制緩沖液的pH及離子強度。樣品與a-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后,才能進行柱層析。
    3、所裝的柱床必須表面平整,無溝流及氣泡,否則應重裝。
    4、洗脫過程中應嚴格控制流速,切勿過快。
    5、上樣的體積要小,濃度不宜過高。
    6、加樣及整個洗脫過程中,嚴防柱面變干。

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