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    技術支持

    溶菌酶純度鑒定與分子量測定

    發布時間:2022-06-20   點擊次數:62次

     一、實驗目的和內容

    目的:1. 通過本次實驗的學習與操作,使學生在實驗過程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)測定蛋白質純度與分子量的原理與依據;

    2. 要求學生掌握電泳原理以及SDS-PAGE垂直板電泳分離蛋白質技術;

    3. 熟悉垂直板電泳操作原理和方法,凝膠染色與脫色方法,凝膠圖譜的繪制與計算;

    4. 了解在電泳中分子量標準物的使用。

    內容:1.SDS-PAGE電泳的原理:SDS使蛋白質的變性作用,以及此實驗中采用的使不連續PAGE膠(分離膠和濃縮膠)的原理;

    2.SDS-PAGE電泳進行純度鑒定的原理:凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質分子量密切相關;

    3.電泳的操作:制膠、加樣、電泳、撥膠、凝膠染色與脫色;

    4.蛋白條帶的觀察以及分子量的估算。

    二、實驗儀器與試劑

    1.實驗儀器

    SDS-PAGE電泳設備,電爐,脫色搖床

    2. 實驗材料及試劑

    實驗材料:蛋清(S1)、粗分離樣品(S2)、離子交換層析中穿透峰下降段樣品(S3)、離子交換層析洗脫峰樣品(S4),橡膠手套

    實驗試劑:2×上樣緩沖液、10%SDS、30%丙烯酰胺貯存液、分離膠緩沖液(1.5 mol/LpH8.8 Tris-HCl 緩沖液)、濃縮膠緩沖液(0.5 mol/LpH6.8 Tris-HCl 緩沖液)、10%過硫酸銨(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly電泳緩沖液、1%瓊脂糖溶液、染色液、脫色液

    三、實驗步驟

    (一)蛋白樣品的處理

    取200?L 上述備用蛋白樣品于帶塞的小離心管中,加入200?L 的2×上樣緩沖液,混勻,輕輕蓋上蓋子,封口膜封緊瓶口以免加熱時迸出,在100℃沸水浴中加熱3~5min,取出后10000r/min 離心10min,取上清待用。

    (二)SDS-PADE實驗步驟(適用于大板,若為天能公司的小板,參考附錄中的方法)

    1.電泳玻璃板洗凈,并把玻璃板在灌膠支架上固定好。( 試樣格(梳子)臨用前用無水乙醇擦拭,讓其揮發至干。)

    2.用電泳緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠,煮沸溶解后冷卻至55℃左右,加入制板槽槽內封板。(固定玻璃板時,兩邊用力一定要均勻,防止夾壞玻璃板.)

    3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入,大約5cm左右,之后加少許蒸餾水,靜置30分鐘。(凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直,并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。)

    4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續平穩加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置25分鐘。(樣梳需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。)

    5.拔出樣梳后,在上槽內加入緩沖液,沒過鋸齒時可拆去底端的瓊脂糖。(要使鋸齒孔內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.)

    6.加樣5個,空出第一個孔,從第二個開始按已編排好的順序依次加入相應體積的樣品和蛋白Marker。其中蛋清(S1)和Marker加樣量為2?L,S1、S2、S3、和S4加樣量為10?L。為了練習和比較上樣量的影響,可以加20?L的S1~S4作為對照(注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉時會發生擴散。為避免邊緣效應,最好選用中部的孔注樣。)

    7.電泳槽中加入緩沖液,接通電源,進行電泳,開始電壓恒定在160V,當進入分離膠后改為240V,溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時,停止電泳。

    8.凝膠板剝離與染色:電泳結束后,用專用工具撬開短玻璃板,從凝膠板上切下一角作為加樣標記,然后放在大培養皿內,加入染色液,42℃染色40min左右。(剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。)

    9.脫色:染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數次,再用脫色液脫色,直到蛋白質區帶清晰。

    10.將凝膠室溫保存于10%甘油水溶液中,至凝膠掃描分析。

    11.凝膠掃描儀掃描并進行數據分析,求出溶菌酶的相對分子質量。分析各樣品中溶菌酶相對含量的變化。

    四、注意事項

    1.N,N’-亞甲雙丙烯酰胺為神經毒性物質,可經皮膚直接吸收,使用時應避免其直接接觸皮膚,必要時應戴手套。但其凝固后就變成無毒物質。

    2.安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲,避免緩沖液滲漏。

    3.用瓊脂(糖)封底及灌膠時不能有氣泡,以免電泳時影響電流的通過。

    4.加樣時樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡,如有氣泡,可用注射器針頭挑除。

    五、演示

    1.垂直電泳系統的組成及工作原理;

    (1)電泳槽:是凝膠電泳系統的核心部分,管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽

    (2)電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200~600V,載體兩性電解質等電聚焦電泳1000~2000V,固相梯度等電聚焦3000~8000V

    (3)外循環恒溫系統:高電壓會產生高熱,需冷卻;

    (4)灌膠模具:制膠,玻璃板和梳子;

    (5)其他:可以選配電泳轉移裝置、電泳洗脫儀、凝膠掃描和攝錄裝置等。

    2.制分離膠與濃縮膠。

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