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    技術支持

    固定化α-淀粉酶及活性測定方法

    發布時間:2022-06-20   點擊次數:61次

     一、實驗目的和原理

    目的:學會交聯法制備固定化酶的操作技術

    內容:制備固定化酶的方法很多,利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間,酶分子與惰性蛋白間,或酶分子與載體間進行交聯反應,以共價鍵制備固定化酶的方法稱為交聯法,本實驗即采用這種方法。交聯劑為戊二醛,載體為甲殼素。

    二、實驗器材

    1.恒溫水浴鍋

    2.恒溫振搖儀

    三、實驗試劑

    1. 5%戊2醛

    2. 甲殼素

    3. 碘原液:稱取碘1.1g。碘化鉀2.2g,置于小燒杯中,加10ml蒸餾水使之溶解,然后轉入容量瓶中。再加少量的蒸餾水洗滌燒杯數次,洗滌液均轉入容量瓶中,最后定容至50ml。搖均后放于棕色試管中備用。

    4. 比色稀碘液:取碘原液2ml,加碘化鉀20g,再用蒸餾水定容至5000ml。

    5. 2%淀粉溶液:稱取2g可溶淀粉,放入小燒杯中,加少量蒸餾水做成懸浮液。然后在攪拌下注入沸騰的蒸餾水中,繼續煮沸一分鐘,冷卻后加蒸餾水定容至100ml。

    6. pH6磷酸氫二鈉——檸檬酸緩沖液:稱取磷酸二氫鈉(Na2HPO4.12H2O)45.23g,檸檬酸(C6H8O7.H2O)8.07g,先在燒杯中使之溶解,然后轉入容量瓶中定容至1000ml。

    7. 標準終點色溶液,

    A液:精確稱取氯化鈷(CoCl.6H2O)40.2493g和重洛酸鉀(K2GrO7)0.4878g,用蒸餾水定容至500ml.

    B液::精確稱取絡黑T40mg,用蒸餾水定容至100ml.

    同時取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用?;旌弦涸?5天內使用有效。

    四、實驗操作

    (一)酶液的制備

    精確稱取α-淀粉酶2g,先用少量40℃pH6的磷酸二氫鈉——檸檬酸緩沖液溶解,溶解過程中輕輕用玻璃棒搗研。將上層液小心傾入100ml容量瓶,沉渣部分再加入少量上述緩沖液,如此反復搗研3—4次。最后,將溶液與殘渣全部移入容量瓶中,用緩沖液先定容搖勻后,通過四層紗布過濾,溶液供測定使用。

    (二)固定化酶的制備

    1. 稱取50mg粉末甲殼素,加入5%戊二醛10ml,調節pH=8.5,攪拌均勻后,于25℃,恒溫振搖1小時。取出后,傾去戊二醛,然后以蒸餾水洗滌,傾去清夜,以除去多余的交聯劑。

    2. 取前面制備的酶液10ml,與上述處理的甲殼素混合均勻,25℃,恒溫振搖1小時,然后4℃冰箱放置過夜。

    1.取出后,4000rpm離心分離,傾去清液,蒸餾水洗滌,可得固定化酶。

    (三)固定化α-淀粉酶活力測定及活力回收率的計算

    1. 首先用吸管取1ml的標準終點色溶液,加至白瓷板的空穴內,作為終點參照的標準。

    2. 固定前總酶活力測定:取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸氫二鈉——檸檬酸緩沖液,加入一支大試管中。將試管置于60℃水浴5分鐘。然后加入前面制備的酶液0.5ml。搖勻后,立即用秒表記錄時間。此后,每經一段時間,用吸管吸出0.2ml反應液,加入預先盛入稀碘液的白瓷板中。當穴內顏色反應由紫色逐漸變為紅棕色并與標準色相同時,即為反應終點,記錄反應到達終點時的時間。

    3. 固定化酶活力測定:取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸氫二鈉——檸檬酸緩沖液,加入一支大試管中。將試管置于60℃水浴5分鐘。然后加入前面制備的固定化酶。搖勻后,立即用秒表記錄時間。此后,不斷振搖,每經一段時間,用吸管吸出0.2ml反應液,加入預先盛入稀碘液的白瓷板中。當穴內顏色反應由紫色逐漸變為紅棕色并與標準色相同時,即為反應終點,記錄反應到達終點時的時間。

    4. 酶活力計算:以60℃、pH6的條件下,每小時水解1g淀粉的酶量為一個活力單位。

    固定前原酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/0.5

    固定后的酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/10

    T:反應到終點時的時間(分)

    n:酶粉稀釋的倍數

    5. 固定化后酶活力回收率計算:

    酶活力回收率=(固定后的酶活力單位/固定前原酶活力單位) × 100%

    五、注意事項

    測定酶制劑時,應先在40℃水浴中懸浮2小時,再用紗布過濾。每次操作所用的紗布數要一致。

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