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    技術支持

    微生物菌體濃度測定方法/細菌計數方法

    發布時間:2022-07-01   點擊次數:52次

     菌體濃度是指單位體積培養液中菌體的含量。

    常用的菌體濃度的測定方法(細菌計數方法)主要有以下幾種:

    1. 直接計數法

    這是一種非常簡單的檢測方法,我們可以利用計數板或計數儀直接得出細菌數目。

    1.1細菌計數板

    首先制備細菌懸液,取一定體積的樣品細菌懸液置于細菌計數板的計數池內,用顯微鏡觀察計數。根據計數室刻度內的細菌數,計算樣品中的含菌數。

    特點:所需設備簡單,測定結果較準確,可迅速得到結果,而且在計數的同時能觀察到所研究微生物的形態特征。不能區分是否為細菌,不能區分活細菌和死細菌。

    單位:個/mL

    計算方法:

    (1)25×16的計數板:

    每毫升細菌數量=(100小格內的細胞數/100)×400×1000×稀釋倍數

    (2)16×25的計數板:

    每毫升細菌數量=(80小格內的細胞數/80)×400×1000×稀釋倍數

    1.2 電子計數器計數法

    電子計數器也屬于直接計數法,其工作原理類似于血細胞分析儀,測定小孔中液體的電阻變化,小孔僅能通過一個細菌,當一個細菌通過這個小孔時,電阻明顯增加,形成一個脈沖,自動記錄在電子記錄裝置上。

    計數單位:個/mL

    特點:該法測定結果較準確,但它只識別顆粒大小,而不能區分是否為細菌。因此,要求菌懸液中不含任何碎片。

    2. 活菌計數法

    常用的有平板菌落計數法(cfu法),其原理是每個活細菌在適宜的培養基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。取一定容量的細菌懸液,制成幾個不同的10倍遞增稀釋液,然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養瓊脂培養基混合,在一定溫度下,培養一定時間后(一般為48小時),記錄每個平皿中形成的菌落數量,依據稀釋倍數,計算出每mL原始樣品中所含活細菌的總數。

    特點:此法靈敏度高,是臨床微生物檢驗工作中最/常用的活菌計數法。前兩種方法會將活與死的細菌全部算入,但是此方法只計算活的細菌。

    計數單位:cfu/mL(cfu是菌落形成單位,是指由單個菌體或聚集成團的多個菌體在固體培養基上生長繁殖所形成的集落,稱為菌落形成單位,是計算細菌或霉菌數量的單位。cfu/mL指的是每毫升樣品中含有的細菌菌落總數。菌落形成單位的計數方式與前兩種計數方式不同,前兩種方法會將活與死的細菌全部算入,但是該方法計算活的細菌)。

    3. 比濁法

    比濁法又稱濁度測定法。為測量透過懸浮質點介質的光強度來確定懸浮物質濃度的方法,這是一種光散射測量技術。常用的方法有:

    3.1 麥氏比濁法

    McFarland發明了一種用于微生物比濁的不同濁度的標準濁度管,具體的配制方法是根據硫酸和氯化鋇的比例來定的

    0.5ml氯化鋇(1.17%)加入99.5ml硫酸(1%),所得溶液濁度即為0.5麥氏單位。0.5麥氏濃度菌液是臨床微生物藥敏實驗常用濃度,通常認為,如將配菌液濃度配成0.5麥氏比濁管時,相當于1.5×108細菌數/mL)。

    麥氏比濁管可以自己配制,也可購買商品化標準麥氏比濁管,將制備的菌懸液與標準麥氏比濁管比較,與多少麥氏濁度的濁度相同即為多少麥氏濃度的菌液。

    特點:該方法實際上為目視比濁法,使用肉眼觀察濁度,誤差較大。

    單位:mcf(即麥氏濁度單位)。

    3.2麥氏比濁儀

    是一種采用麥氏比濁法的自動化分析儀器,以其靈敏、準確、快捷的優點逐漸取代人工法成為細菌濁度測定的主要工具。麥氏比濁儀測量細菌溶液樣品并直接顯示麥氏單位濁度值,根據國際通用麥氏單位濁度值與細菌數的關系即可換算出細菌濃度。

    特點:簡便快捷,但只能檢測含有大量細菌的懸浮液,得出相對的細菌數目,對顏色太深的樣品,不能用此法測定。

    單位:mcf(即麥氏濁度單位)。

    3.3光電比濁法

    當光束通過懸濁液時, 由于被散射或吸收而降低其透過量,細菌懸濁液的濃度在一定范圍內與光密度成正比,與透光度成反比,這就是光電比濁法的依據。常用的有分光光度計法。

    特點:此方法簡單快捷,但只能檢測含有大量細菌的懸浮液,得出相對的細菌數目,對顏色太深的樣本,不能用此方法。

    單位:OD值(光密度)。

    4. 測定重量法

    此法分為是干重法和濕重法。此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養物經離心后將濕菌體進行稱重;干重法系單位體積培養物經離心后,以清水洗凈放人干燥器加熱烘干,使之失去水分然后稱重。

    特點:此法適于菌體濃度較高的樣品,是測定絲狀真菌生長量的常用方法。

    單位:mg/mL

    5、測定細胞總氮量或總碳量

    氮、碳是細胞的主要成分,含量較穩定,測定氮、碳的含量可以推知細胞的質量。

    特點:此法適于細胞濃度較高的樣品。

    6、顏色改變單位法(colour change unit,簡稱CCU)

    ccu是顏色改變單位,以微生物在培養基中的代謝活力為指標,根據培養基顏色的改變來計數微生物數量的單位。

    以解脲脲原體為例:

    1、取12只無菌試管,每一管裝1.8mL解脲脲原體培養基。

    2、在第一管加入0.2mL待測解脲脲原體菌液,充分混勻,從中吸取0.2mL加入第二管,依次類推,10倍梯度稀釋,一直到最末一管。

    3、37℃培養,以培養基顏色改變的最末一管作為待測菌液的CCU,也就是支原體的最大代謝活力,比如第六管出現顏色改變,他的相對濃度就是10的6次方CCU/mL,即106CCU/mL。

    特點:這種方法通常用于很小,用一般的比濁法無法計數的微生物,比如支原體等,因為支原體的液體培養物是完全透明的,呈現為清亮透明紅色,因此無法用比濁法來計數;而由于支原體固體培養很困難,用cfu法也不容易計數,所以需要用特殊的計數方法,即CCU法。

    單位:ccu/mL

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